Tau-PTM图谱识别患者的异质性和阿尔茨海默病的分期

蛋白质可以通过PTMs进行修饰，从而产生不同的蛋白质形式（Smith等人，2013年）。这些PTMs的组合负责调节和微调蛋白质的构象和活性（Aebersold et al.，2018；Soria et al.，2014），并可显著改变蛋白质的功能和毒性。为了有效地理解蛋白质修饰的功能意义，所有可能的PTMs都应该从N端mapped 到C端。尽管一些PTM存在于细胞的基础水平，但并非所有这些在特定病理条件下都具有重要的功能（Singh等人，2014）。因此，要了解特定PTM的功能，获得关于PTM化学计量的信息同样重要。

了解人体Tau在疾病和健康方面的知识，对于开发正电子发射断层扫描（PET）试剂和治疗剂等诊断技术具有重要意义。例如，为了开发一种用于在认知能力下降之前检测疾病的Tau-PET放射性示踪剂，疾病早期阶段病理物种的化学成分和丰度至关重要（Brosch等人，2017）。此外，对病理类型的Tau-PTMs模式的了解将有助于改善PET试剂对Tau的亲和力。在疾病发展过程中，确定病理性Tau蛋白质形式的化学特性，将使研究者能够在疾病的每个阶段使用治疗性抗体或小分子来靶向特定的表位。此外，对于寡聚物形成和Tau 聚集重要的PTM的最小集合还不清楚。最后，还不知道哪些PTM发生在Tau seeds上，从而增强了进一步的聚集。PTMs在启动Tau   seeding 和propagation中的作用机制仍有待阐明（Guo等人，2017；Wang和Mandel-kow，2016）。

为了了解PTM在疾病中的重要性，对一个队列中的PTM进行全面分析需要多层次的信息，包括（1）PTM的类型，（2）PTM的定位，（3）受试者队列中的PTM频率，以及（4）PTM的化学成分。因此，对人类组织（n=91）进行了定量和定性蛋白质分析。

结果：

1在人类受试者的Tau上发现了95个翻译后修饰（PTMs）（49例AD和42例对照组的死后人体组织）

2 病理性Tau的频率和PTM化学计量确定患者的异质性

3 修饰以过程的方式发生，反映疾病的进展

4 这项研究确定了疾病各个阶段的关键治疗目标

Tau蛋白在疾病的不同阶段对疾病干预至关重要，包括0N和4R异构体的富集、C端的低表达、富含脯氨酸区域（PRR）负电荷的增加和微管结合域（MBD）的正电荷减少。

左侧面板根据PTM在层次聚类中的重要性对PTM进行排序，而右侧的热图描述了PTM按其在2N4R Tau上的位置排序。右图为亚型、PTM类型、病理诊断、临床诊断对照组（CTR）、轻度认知功能障碍（MCI）、皮克氏病（PiD）、帕金森病（PD）和Braak分期。

PTM和异构体的类型用颜色编码在顶部的条形图中，诊断显示在左侧。

采用Jaccard二元聚类（橙色，PTM已识别；紫色，PTM未识别）

对49例AD患者和42例年龄匹配的健康受试者的shotgun-MS的Tau-PTM图谱数据进行了层次聚类分析。

分析将受试者分为不同的子组，这些子组基于由多个PTM组合组成的独特Tau PTM特征。

分析将受试者分为4组（a、b、c和d），其中c组是Braak分期最高的组，a组是Braak分期最低的组。在左面板下面，研究者列出了5种将集群分为4组的PTM组合。

根据MaxQuant的修饰肽强度，PLS-DA将受试者按其病理诊断进行分离，并鉴定出25种肽是最具鉴别力的修饰肽。VIP图位于右侧，研究者使用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），按其在将AD与对照组患者分开时的重要性对这些PTM进行排序。

红色和蓝色方块显示肽是减少（红色）还是增加（蓝色）在各自的疾病组。（p值：***p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.1）。

结果发现：将残基K311和K317处的单泛素肽和双泛素肽以及两个磷酸肽（T217和S262）列为在使用翻译后修饰肽的定量数据，区分AD和对照组时最明显的。

对AD患者和年龄匹配的对照组进行的flexiteau分析显示，定量修饰谱存在异质性。

FLEXITau提供了Tau中肽修饰程度的测量方法。左边的面板根据肽在等级聚类中的重要性对每个被测肽的修饰程度进行排序，而右边的热图描述了按照它们在2N4R Tau 上的位置排序的肽。右边是队列1受试者的肽修饰程度、病理诊断、临床诊断和Braak分期的图例。

在队列1（29名AD患者与28名CTR受试者）中，使用FLEXITau测量了Tau 肽的Unsupervised Euclidian 分层聚类。FLEXITau聚类分析将受试者分为3大类（x、y和z），最显著的特征C端肽、MBD中的R3–R4和PRR被化学计量。

FLEXITau肽修饰程度的PLS-DA根据其病理诊断将受试者分开，并识别出三种最具鉴别力的肽（VIP评分图）。红色和蓝色方块显示肽是减少（红色）还是增加（蓝色）在各自的疾病组。

这将R4肽14（354-369）、含有S212、S214、S217和T220磷酸位点的PRR肽8（212-221）和C端肽17（407-437）列为在AD组和对照组之间进行区分时最明显。

Spearman相关分析显示PRR和1N/2N特异性肽是反相关的，两个队列中MBD的丰度都增加了。 队列1中相关肽和反相关肽的相关图。FLEXITau数据显示PRR和C末端PTM程度增加，MBD在AD不溶性聚集物中富集，并提供了有关修饰过程性的信息。

数据预测模型的有效性：模型在队列1上训练，在队列2上测试，结果AD和对照组的AUC分别为0.934和0.98。

分析了四种不同的Tau组分：

（1）sarkosyl-soluble   Tau（“可溶性”），

（2）MC1分离Tau（通过MC1抗体免疫亲和柱从可溶部分分离出来；Jicha等人，1999b），

（3）可溶性低分子量（LMW）Tau（-50kDa），

（4）低聚物高分子量（HMW）Tau（>120kDa）；后两者通过大小排阻色谱法进行分离（Takeda等人，2015）。

工作流程示意图，用于分离大小分离的可溶性部分，seeding-competent 的 HMW Tau低聚物和seeding-incompetent 的LMW Tau。

不同组分中N端和C端FLEXITau定量肽的比较分析。

当研究者比较左上方面板中LMW和HMW Tau物种的分布时，研究者发现包含N端到PRR末端的未修饰本质无序域在LMW Tau中的比例过高，这在生物传感器分析中是seeding incompetent部分（Takeda et al.，2015），而修订过的MBD的比例过高是在HMW-Tau 是seeding-competent 部分。

当以这种方式比较AD（seeding-competent）和对照（seeding incompetent）受试者的sarkosyl-insoluble fraction时，研究者得到了类似的结果。两种seeding-competent fractions HMW Tau和较大的纤维化不溶性Tau的对比分析显示出相似的模式；然而，MBD在不溶性部分中更丰富，肽260-267的代表性不足，表明该肽的磷酸化化学计量比更高（S262和T263）。

图4C显示了五个组分中Tau肽的PTM范围。seeding incompetentAD和对照Tau-sarkosyl可溶部分没有差异；两者都富集在N-末端区域。

这些定量数据表明，Tau的N端与seeding capacity呈负相关。相反，高浓度的MBD与种子活力和纤维大小呈正相关。

在图4D中，绘制了5种所述Tau 物种的修饰剖面图。LMW-Tau显示出与sarkoy可溶部分相似的Tau修饰模式，PRR中的5个磷酸化（T181、S198、S199、S202和T231）是LMW和sarkosyl可溶部分中一致观察到的位点。

不同组分的Tau物种的大小差异：sarkosyl-soluble, LMW, HMW, MC1 antibody isolates, and sarkosyl-insoluble [#表示2N4R Tau 中的氨基酸位置]。

疾病患者和对照组患者的化学计量Tau-PTM图谱可识别关键PTM和聚集相关区域不同PTM在疾病不同阶段的顺序累积示意图。随着疾病的进展，PRR中磷酸化的增加，MBD中的乙酰化和泛素化也随之增加。

具体来说：

聚类a的最低平均Braak期为0-I，仅显示Tau（BA39）的磷酸化，PRR有3个位点，aa400-404中有3个位点。

在d类 中，平均Braak阶段为III–IV的受试者，研究者观察到在S396处PRR结构域和C末端增加了6个额外的磷酸化位点。

在b类中，平均Braak阶段为V或VI，研究者观察到MBD中多个位点出现乙酰化和泛素化。在c类中，随着VI的最高Braak阶段，研究者观察到从N到c末端的PTM总体上增加。

总结FLEXITau数据的示意图，显示了导致患者之间tau 聚集的三步过程。1N和2N亚型在所有不溶性Tau中都没有表达。观察到的一个早期事件是C端的断裂，随后是PRR的磷酸化和MBD的富集。和对照组相比，AD患者的MBD明显增加。

定性数据与定量数据一致。FLEXITau数据识别了与病理学相关的Tau区域；例如，确定为定义AD的三个肽分别是MBD域，在AD患者中增加；PRR，在疾病中高度修饰；以及末端C末端肽，其未经修饰的形式被低估，可以用caspase裂解解释。

基于研究者的化学计量PTM分析，研究者提出了Tau纤维形成的模型。0N和4R亚型易于聚集。一连串的PTM，包括C端断裂，PRR中的负电荷磷酸化，随后在富集的MBR中进行电荷中和乙酰化和泛素化，是Tau原纤维形成和AD疾病进展过程中的渐进步骤。