结核与分子生物学诊断

3月24日是世界防治结核病日，我国今年的主题是“终结结核流行，健康自由呼吸”。

虽然随着卫生条件的改善，生活方式的改变，越来越多人加强了身体的锻炼，提高了机体抵抗力，结核病死亡数量相对之前下降了，但它仍是全世界十大死因之一。

我国是全球30个结核病高负担国之一，每年新发结核病患者89.5万例，位居世界第三位；耐多药结核病患者5.8万例，位居世界第二位^（1），因此，结核病成为制约我国社会经济发展的重大公共问题之一^（2）。

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)引起的传染性疾病。

结核病按照发病部位可分为肺结核与肺外结核。肺结核指发生在肺实质的结核病。肺外结核指发生在肺脏以外器官的结核病，常见发病部位有胸膜、淋巴结、骨与关节、脑膜与脑、皮肤、肠道及泌尿生殖系统等。

结核病中又以肺结核最为多见，早诊断、早隔离、早治疗是减少肺结核发病和死亡的关键环节，诊断的滞后导致个体化治疗的延误和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的传播^（3.4）。

目前结核分枝杆菌诊断主要检测方法有结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等。

痰涂片检查价格低廉、操作简便，但敏感度不高；痰培养敏感度较高，一直作为结核病实验室诊断的金标准，但因其检测周期过长，不能为临床提供时效性检测结果^（5.6.7）。

T-SPOT.TB 也是临床上应用价值较高的结核分枝杆菌的病原免疫学检查，其优势是准确、可信、快速的结核监测，但其阴性结果虽提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，如出现以下情况，阴性结果不能排除结核杆菌感染的可能:

1）因感染阶段不同(如标本是在细胞免疫发生前获取的)引起的假阴性结果;

2）少数免疫系统功能不全的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、儿童等;

3) 以及其它免疫学、实验非正常操作的差异。

如是阳性结果则提示患者体内存在结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否为活动性结核病，需结合临床症状及其它检测指标综合判断。所以T-SPOT.TB结果不能作为单独或是决定性的诊断结核病的依据，需联合多种实验室方法检测，能有效提高结核诊断的准确率^（8）。

随着基因工程的不断发展，有力地推动了临床检验从宏观扩展到微观领域，从细胞水平深入到分子水平。

WHO于2013年修订了结核病的诊断标准，将分子生物学方法检测阳性的患者纳入病原学阳性的范畴。我国也于2017年重新修订了肺结核诊断标准，此标准中将分子生物学诊断阳性作为病原学阳性的诊断依据。

根据各种诊断技术的检测原理，将现有的结核病分子生物学技术分类如下：

1．探针－反向杂交技术（线性探针、基因芯片）^（9）：

是利用特殊标记的探针(DNA短片段)与特异性扩增PCR产物(靶DNA序列)在一定条件下按碱基互补原则，通过氢键作用形成双链分子，这种双链分子通过荧光基团或生物素标记后，可通过自显影或显色反应检出，上述通过已知的探针序列检测未知标本中靶标基因序列的方法称为探针－反向杂交技术。目前，此技术包括线性探针及基因芯片等主要用于MTB对利福平和异烟肼耐药性的检测及分枝杆菌菌种的鉴定。

2.实时荧光定量PCR技术（Gene Xpert MTB/RIF、MTB复合群核酸检测试剂盒（实时荧光PCR法））^（9）：

其主要原理是通过荧光基团标记的特异性探针(Taqman探针或分子信标)对基因扩增产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应软件对产物进行分析。目前，实时荧光定量PCR技术主要用于检测临床标本中是否存在MTB复合群及其对利福平的耐药性，检测的标本类型包括痰、胸腔积液及脑脊液等标本，检测结果阳性可视同标本中存在MTB复合群。

3.探针－熔解曲线技术（MTB系列耐药突变检测试剂盒）^（9）：

是基于对特异性扩增产物与探针形成双链的解链温度进行检测，从而完成对靶标基因的序列分析。由于DNA双链的解链温度由核酸分子碱基长度或碱基组成等因素决定，通过对扩增产物熔解曲线的分析，判断序列中是否存在基因突变。熔解温度的降低提示检测序列中存在一个或多个基因突变，但不能确定基因突变的类型。该技术可有效鉴定多种基因型的存在，特别适于低丰度的异质性耐药检测，目前用于利福平、异烟肼、乙胺丁醇和喹诺酮类药物耐药性的检测。

4.等温(恒温)扩增技术^（9）：

是一类分子生物学诊断技术的简称，其特征为基因扩增过程不需要检测温度梯度的循环，仅需要在恒定温度下完成扩增，因此等温扩增技术对仪器设备的依赖性较低。等温扩增技术基于其独特的扩增原理，其敏感度高但特异性相对较低，对防污染措施要求严格，其自动化程度越高，检测结果可信度越高。由于SAT扩增产物为RNA，在环境中极易降解，一般在排除样品留存环节的污染RNA后，检测结果阳性可视为标本中存在活菌。目前，等温扩增技术主要用于检测临床标本中是否存在MTB复合群。

5．病原体宏基因组检测^（10）：

传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序（以下简称二代测序）技术检测能覆盖更广范围的病原体。

二代测序在组织感染方面，对创伤弧菌、非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌等均有较强的诊断价值。

一项研究提示与培养相比，二代测序对结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌的检出率均显著高于培养；以临床诊断为金标准，二代测序比培养显著提高了灵敏度（50.7％比35.2％ ）。

肺组织二代测序对细菌感染的灵敏度可达100％，特异度为76.5％。

在另一项针对结核性脑膜炎患者的队列研究中，二代测序同时被证实可提高患者的病原体检出率。

所以，在临床上二代测序可用于分枝杆菌病原菌的耐药检测和菌种鉴定。

MTB分子生物学诊断技术是现代分子生物学与检验医学结合取得巨大进步的结晶^（9），也是在人们对MTB基因功能、调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的，对于诊断结核病有重要的临床意义。

参考文献：

（1）[1]world Health 0rganization．Global tuberculosis report 2017[M]． Geneva：World Health 0rganization，2017．

（2）wang L，zhaIIg H。Ruan Y，et a1．Tuberculosis preValence in China。1990—2010；a lontudinal analysis“national survey data[J]．Lancet，2014，383(9934)：2057．20“．DOI：lO．1016／SOl736(13)62639．2．

（3）Golub JE，Bur S，Cronin WA，et a1．Delayed tuberculosis diagnosisaIld tIlberculosis tmsIIlission[J]．Int J TubeI℃Lung Dis，2006 10(1)：24-30．

（4）Sreemmareddy CT，Pandum KV，Menten J，et a1．Time delays in diagnosis of pulmonary tubeI_culosis： a systematic review of literature[J]．BMC Infect Dis，2009，9(1)：91．DOI：10．1186／1471．2334.9-91．

（5）Pai M，Schito M．Tuberculosis diafostics in 2015：laIldscape， priorities，needs，d prospects[J]．J Infect Dis，2015，2ll (Suppl2)：S2l-S28．DOI：lO．1093／infdiiu803．

（6）Denkinger CM，Kik SV，Cirillo DM，et a1．Defining tlle needs for next generationsays for tuberculosis[J]．J Infect Dis，2015， 21l(Suppl 2)：S29一S38．DOI：10．1093／infdis／jiu821．

（7）朱长太，胡忠义．结核分枝杆菌耐药性检测技术进展[J]．中华结核和呼吸杂志，2011，34(10)：768．770．DIO：10．3760／ ema．j．issn．1001 J0939．

（8）范伟光等.结核感染T细胞（T-SPOT.TB）应用于结核诊断的临床意义.中国实验诊断学，2016，06，20，6.

（9）《结核病病原学分子诊断专家共识》,中华结核和呼吸杂志2018年9月第41卷第9期.

（10）《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》，中华传染病杂志2020年11月第38卷第11期.