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新技术助力冠状病毒快速检测

前言

自2019年底爆发的武汉肺炎疫情引发社会的广泛关注,截至2月15日,累计确诊人数66576,治愈8163例,死亡1524例,在医疗等各行业人员的共同努力以及国外的友好援助下,疫情已逐步得到控制。而新型冠状病毒的检测诊断是有效控制疫情的重要环节,高效的病毒检测技术也已成为研发的热点。


国家卫健委发布的新冠肺炎诊疗方案试行第五版提出以电子计算机断层扫描(CT)的影像学特征和核酸检测的病原学特征作为主要诊断标准。两种检测手段各有优劣、互为补充,不能认为某种方法可以完全取代。

由于新型冠状病毒主要通过下呼吸道侵染,引发肺部细胞炎症、病变、坏死,因此通过CT断层扫描可发现感染者肺部小斑片影及间质改变从而起到筛查作用。CT检测新型肺炎检出率高,结果较为可靠稳定,筛查快速及时,同时可以判断肺炎病程,但耗费巨大,不适合大范围推广,同时无法鉴别病毒类型,对早期病症无法排查;负面作用较大。而核酸检测是基于聚合酶链式反应(PCR),简单来说,其工作原理类似于复印机。复印原件就是基因组DNA,通常样品中混杂多种基因组不易有效区分,因此需要设计特定的标志——引物,使得仅对我们需要的部分进行“复印”,在加入“原件”、“标志”、“墨水”(核苷酸)后,分子机器——DNA聚合酶就能够进行高效的“复印”,一变二、二变四、……经过30轮循环(约2h)就可使原本微量的“原件”复制几百万倍。冠状病毒基因组与其他生物基因组不同,是由RNA构成的,因此需要首先要提取灭活样品中的病毒RNA,通过额外的步骤将RNA逆转录为DNA,这好比是“抄录”所需内容再“复印”。由于无法直接观察复印数量,通常采用荧光标记“墨水”或“标志”,就使得“复印”文件时产生荧光信号并通过“打印机”记录循环数。当人为设定“复印”限度时,如果复印前原件越多,复印较少的次数就可达到限定值,从而可以比较病毒原件的多少,新型冠状病毒核酸检测标准是循环数(Ct)<37可认定为阳性。由此可以看到核酸检测相较于CT检测具有更高的灵敏度、成本相对较低,因此普遍推广,但是常规定量PCR由于取样方式、污染常导致假阳性或假阴性,而且步骤复杂、耗时较长(2-4h)。


为缩短诊断时间,提高检测准确性,推动疫情筛查、隔离、治疗,研究者优化常规核酸检测方法、创新检测技术,已开发了许多有效的试剂盒、检测平台,有望用于临床检测。

酸检测


为满足新型肺炎的诊断需要,全国多地已自主研发了新冠病毒检测试剂盒,结合纳米磁珠等技术简化了核酸提取流程,使用核酸提取全自动仪降低人力、时间成本,全自动封闭检测平台避免气溶胶传播,微流控系统加速PCR扩增反应,提高引物灵敏度识别二代三代病毒感染。

中国计量科学研究院成功研制了针对新型冠状病毒的高灵敏度数字PCR检测方法,数字PCR相当于在常规定量PCR基础上将“原件”分拣到不同“复印机”,每台“复印机”对单个原件“复印”,避免通过循环次数比较"原件"的误差,从而实现绝对定量,减少假阴性结果,提高结果可靠性,排除复杂样本的背景干扰。目前该方法和试剂盒已完成部分系统优化和验证实验,将逐步应用到临床。


之前所述的基于PCR技术的检测,尽管能够精准高效地检测病毒基因,但是依赖于精密的PCR仪,而且耗时较长限制了其在即时检测方面的应用。环介导等温扩增技术是一种新型核酸检测策略,该技术利用特殊的分子机器——具有链置换能力的DNA聚合酶,可以理解为特殊的“复印“方式,普通的分子机器只能单张“复印”,而该类分子机器能够在“标记”引导下将多张原件连接起来“复印”,同时新“复印”出来的复印件又可与原件串联起来“复印”,因此其灵敏度与反应速率远高于传统PCR反应,而且无需特殊装置,可视化观察。疾控中心病毒病预防控制所和江苏奇天基因生物科技公司联合研制了CoVID-19核酸等温扩增快速检测试剂盒,提取核酸后8-15分钟就显示结果,可能实现便携式测定。该试剂盒检出率与商业用PCR试剂盒检出率完全一致,目前已在三家医疗机构开展临床评估。


CRISPR技术在冠状病毒快速检测方面也有很大潜力。麻省理工学院张锋团队在2017年开发了基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK(特异性高灵敏度酶促解锁)系统,可用于病毒感染检测;在2019年又将该系统进一步优化为CARVER(Cas13辅助的病毒表达和读出限制)系统,具有潜在的诊断RNA病毒感染和治疗作用。近日,张锋团队利用SHERLOCK系统实现对COVID-19的快速检测,该系统核心组分为Cas13和等温扩增反应相结合。与之前所讲的等温扩增反应不同,该体系加入了其他分子机器——重组酶和单链结合蛋白等,模拟体内核酸的“复印”方式,在常温下即可扩增DNA或RNA。Cas13起到“分子剪刀”的作用,在crRNA引导物的指引下,“剪刀头”能够切割目的RNA,同时“分子剪刀”整个激活,其“刀身”也可剪切其他RNA。首先通过重组酶聚合酶将目的DNA和引导物RNA扩增,再全部转录为RNA,以便“分子剪刀”有效识别,存在目的RNA情况下,“分子剪刀”就会肆无忌惮地进行切割,报告分子就被切割并释放荧光,整个流程高效灵敏、条件温和、成本低廉,1h内就能完成整个检测,目前还未进行临床样本的测试。
华大智造与上海吐露港生物科技联合开发了新型冠状病毒快速检测方法,基于磁珠法的全封闭核酸自动提取平台DNBelab D与CRISPR检测相结合实现1h内冠状病毒的快速、精准检出。

免疫学检测


核酸检测基于核酸分子的碱基互补配对原理,需要经过放大扩增的循环才能检测到信号,因此需要较长的时间增强信号,免疫学检测方法则是抗原抗体的结合,通过凝集反应、显色反应即可快速、灵敏鉴定,无需进行样品的纯化、提取。
丽珠试剂联合中科院武汉病毒所研发首个新型冠状病毒IgG、IgM 酶联免疫和免疫胶体金试剂盒,人感染病毒后,机体的免疫系统首先通过天然免疫阻断病毒,进而产生特异性的抗体结合到病毒表面,感染后1-2周左右即可出现IgM抗体,IgM抗体反映急性感染,出现最早、消失最快,IgG抗体随后产生,并维持较高的浓度,在机体免疫中发挥主要作用,因此通过检测特异性的IgM、IgG,可以鉴定新冠病毒并测定病毒滴度,为临床诊断提供血清学的证据。该技术适合较大规模的筛查,对实验室要求低,可有效排除核酸检测的假阴性。目前已进入国家应急审批通道。

南开大学与国内多所高校及相关生物医药企业的科研团队联合攻关,成功研制出COVID-19 IgM/IgG抗体快速检测试剂盒和快速测试卡,结合聚集诱导发光(AIE)、量子点、胶体金等技术,实现15min内快速检测,检出率75%,具有操作简便、灵敏度高、易观察等优点。与此同时,钟南山院士团队联合中科院广州研究院等研发新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒,团队应用胶体金免疫层析技术,仅需采取一滴血就能在15分钟内肉眼观察条带,能够检出相当一部分的核酸检测阴性患者,目前已在实验室和临床完成初步评价,有望广泛用于家庭和医疗机构的初步检测。深圳大学等研究单位也联合开单人份化学发光新冠病毒抗体检测试剂盒,可以在22分钟完成对新冠病毒感染的快速诊断,已进行初步临床评估。


此外,病毒感染过程通常会导致免疫系统衰退,进而引发其他病原物感染,因此对于多种病原体的同时检测具有重要临床价值。香港理工大学团队研发了一套全自动快速多重诊断系统,可于1小时内检测出包括新型冠状病毒在内的30至40种病原体,能够快速、简便、高通量测定。

总结


多种检测新方法的突破性进展是科研工作者不懈钻研的结果,这将有助于新型冠状病毒诊疗水平的提高,促进疫情的有效控制。不同检测方法各有优劣,可以相互补充,多种方法联用提高检测方法的精准度。

检测技术

优点

缺点

荧光定量PCR

技术成熟,重复性好

耗时较长,成本较高

数字PCR

精确、灵敏,抗背景干扰

耗时长,价格昂贵

环介导等温扩增

快速、灵敏、条件温和

需要特殊引物和聚合酶

特异性高灵敏度酶促解锁

快速、灵敏、精确

需要特殊酶系,易引发脱靶效应

酶联免疫吸附法

简便、精确测定

抗体成本较高

抗体快速检测

简便、快速、易观察

抗体成本较高,检出率低


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