寡克隆区带—你是谁，来自哪里，要到哪去？

1、单克隆，寡克隆，多克隆

电泳是利用不同蛋白质带的电荷不同在同一电场中泳动速度不同而把蛋白质区分开的方法。单克隆抗体来自单一的浆细胞株，即同一个祖先（浆细胞）分裂，增殖而形成的一簇细胞株系，同一克隆的B细胞产生同样的均一的免疫球蛋白区带。寡克隆抗体来源于许多细胞株，即电泳上应该有2条或以上区带。多克隆抗体是所有的免疫球蛋白均增加，在电泳背景下无特殊的可分辨清楚的克隆区带。单克隆反应可能是多克隆反应的开始阶段，此时未发现其他抗体克隆，也可能是检测方法不敏感所致；寡克隆反应代表对某种特殊抗原或一系列抗原的体液免疫反应，同许多感染、自身免疫和炎症疾病有关。多克隆代表免疫球蛋白非特异性增加，常与系统性疾病有关，此时对许多抗原产生免疫反应，在神经系统疾病中不多见。

2、寡克隆区带的发现

1959 年, 有学者用琼脂糖凝胶电泳法从亚急性硬化性全脑炎患者CSFγ球蛋白（免疫球蛋白）中分离出几个光密度不同的条带;

图1   血清蛋白分离图-免疫球蛋白多出现在γ峰，所以免疫球蛋白又叫γ球蛋白或者丙种球蛋白，泛指所有的抗体

1960 年, KUTT 也发现多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)患者 CSF 电泳后在靠近阴极端形成狭窄而不连续的区带; 1971年, 由 LINK 用免疫电泳法证实这些区带是由浆细胞克隆激活分泌的IgG 分子进入CSF而构成, 并命名为OCB IgG 区带。正常人体内, 有无数淋巴B细胞克隆株合成的免疫球蛋白, 电泳时在γ球蛋白区域形成均匀连续的区带谱, 称为多克隆免疫球蛋白区带。但在疾病情况下, 某几个克隆株浆细胞异常增生, 合成的免疫球蛋白在电泳时可在γ 球蛋白区域形成几个狭窄且不连续的区带谱, 即为OCB。OCB 以IgG为主, 也可出现IgM或IgA。CSF中OCB的出现往往高度提示有免疫球蛋白的鞘内合成。但在某些疾病情况下, 由于血脑屏障遭破坏, 活化的B细胞由血液进入CNS, 导致血清和CSF中均含有相同的OCB。因此, 配对检测血清和CSF中的OCB可以更准确地判定CNS内是否存在免疫球蛋白的局部合成。

3、寡克隆区带的出现机制

寡克隆区带的出现是因为鞘内抗体的合成，那么鞘内抗体是如何合成的呢？

（1）中枢神经系统存在B淋巴细胞

很长时间内人们都认为中枢神经系统（CNS）由于血脑屏障的存在是个免疫豁免的区域。但是，当发生中枢神经系统感染的时候，CNS会迅速的产生针对病原体的抗体；在体外实验中向大鼠CNS区域注射抗原，也可以检测到针对抗原的特异抗体及B淋巴细胞的聚集。这些事实都证明中枢神经系统并非免疫豁免区，同样在免疫系统的监控之下。最终人们在健康人的脑部组织中观察到了B淋巴细胞的存在。

图2   在正常脑组织中发现的CD20+的B淋巴细胞

（2）鞘内抗体的合成途径

骨髓中的造血干细胞在骨髓中依次分化为祖B细胞，前B细胞，初始B细胞。初始B细胞离开骨髓来到次级淋巴器官（主要是脾脏），在次级淋巴器官的滤泡内被抗原活化（B细胞发生体细胞高频突变，产生与抗原亲和力更高的抗体），分化为产生抗体并保持增殖能力的浆母细胞和记忆细胞。浆母细胞一边分化为浆细胞，长期在骨髓中存活，一边迁移到炎症部位，比如中枢神经系统（第一条途径）。产生的记忆细胞同样可以迁移到中枢神经系统，直接被抗原激活，成为浆母细胞（第二条途径）。记忆细胞同时也可以迁移到中枢神经系统中滤泡样结构（同样可以检测到B细胞的体细胞高频基因突变），产生浆母细胞（第三条途径）。迁移到CNS中的记忆细胞也可以与T细胞发生旁观者反应，直接分化为浆母细胞（第四条途径）。

图3   中枢神经系统抗体产生的四种可能途径

浆母细胞分化为浆细胞，在MS患者中，星形胶质细胞和小胶质细胞可以产生很多细胞因子，保持浆细胞在CNS中长期存活。这也许是很多MS患者会一直保持OCB阳性的原因。

图4 MS患者中浆细胞表达的受体及结合的相关配体，保持浆细胞在CNS中长期存活

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法

将待测CSF或血清样本进行电泳分离, 经染色后观察。此法较简便, CSF无需浓缩, 便于一般临床实验室开展。但该法敏感性和阳性率均较低, 缺乏IgG特异性, 已被MS 国际专家组及美国食品和药品管理局淘汰。

2. 琼脂糖电泳等电聚焦结合免疫印迹检测

在电解槽中加入两性电解质, 通以直流电, 形成由阳极至阴极逐渐增加的pH 梯度, 将CSF与稀释后的对照血清依次点加在阳极, 根据蛋白质分子的等电点不同, 经电泳不同蛋白组分即可移动并聚焦于其等电点 pH 位置, 经染色即可观察结果。该法比聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法特异性好、敏感性高、分辨率好。等电聚焦结合免疫印迹检测是目前国际公认的判定CSF-OCB 的金标准, 在临床应用最广泛。

图5 琼脂糖电泳等电聚焦结合免疫印迹检测结果图

3.毛细管电泳等电聚焦结合免疫印迹检测

毛细管电泳的方法是继金标准方法后开发的新的检测方法，相比金标准方法有更快的检测速度，更高的通量，更高的敏感度。在一项研究中其敏感性为100%（n=27），包括金标准没有检测出来的2例样本；特异性为97.5%（n=19）。

图6 毛细管等电点聚焦电泳电泳图，A图：OCB阳性；B图：OCB阴性

4.OCB结果判断

常见的CSF-OCB 结果有5种图型，具体见图7。

         图7 常见的CSF-OCB，(a)患者CSF及血清样本中都未出现OCB, 提示患者CNS未出现相关的免疫性疾病; (b)CSF样本中出现狭窄的、不连续的OCB, 而血清样本相对应的位置并无区带, 提示存在IgG鞘内合成; (c)患者CSF及血清样本均出现了同样的条带, 且CSF还存在额外的区带, 显示同时存在血脑屏障损伤及IgG鞘内合成; (d)CSF及血清样本均出现了完全相同的OCB, 提示存在血脑屏障损伤; (e)CSF及血清样本出现了完全相同的连续均一的条带, 为单克隆区带，常见于单克隆免疫球蛋白病。虽然(b)、(c)、(d)和(e)图均提示产生了体液免疫反应, 但仅(b)和(c)图提示存在IgG鞘内合成, 是反映CNS病变的重要标志, 可以判断为阳性结果。

总之, 目前临床上对于CNS疾病特别是脱髓鞘病的诊断主要依赖影像学检查和临床表现进行分析, 但由于此类疾病在早期病理学改变并不明显, 影像学检查和常规检查并不能有效地及时发现, 由于CSF IgG的增加发生较早, 所以对患者血清和CSF同时进行电泳以检测OCB是否存在, 同时结合其他免疫学指标如IgG指数、24 h IgG合成率、病毒感染抗体及分子生物学指标, 是早期诊断CSF疾病的有效途径。